寶藤生物與東方肝膽外科醫院合作揭示膽囊結石與膽囊癌的進化關系

22 June 2020

[寶藤生物]

近日,寶藤生物與上海東方肝膽外科醫院膽道外科合作,通過對不同患病時間的膽囊結石患者和膽囊癌患者的手術組織樣本進行轉錄組測序,揭示了膽囊結石的攜帶時間與患膽囊癌風險的關系。研究成果《RNA Sequencing Revealed Signals of Evolution From Gallbladder Stone to Gallbladder Carcinoma》于2020年5月發表于frontiers in Oncology。

研究背景

膽囊癌發病率低,但是惡性程度極高,平均總生存期僅為6個月左右,5年生存率約為10%。由于膽囊癌早期無明顯癥狀,因此患者確診時多已發展為晚期。膽囊結石是膽囊癌的第一大危險因素,膽囊結石的患者,由于結石對膽囊壁的長期刺激,膽囊壁會增生變厚,從增生/化生,到異常增生,再到癌變,這個過程大概需要5到15年的時間。腹腔鏡膽囊切除是治療有癥狀膽囊結石的首選策略,那么對于沒有癥狀的膽囊結石需要做手術嗎?

研究目的

在臨床中,有癥狀的膽結石患者首選手術治療,而對于無癥狀的膽結石患者進行長期隨訪觀察。當觀察時間過長時,臨床上也建議把手術做掉為妙。但是無癥狀患者對于膽囊切除手術往往是持拒絕態度的。

無癥狀膽囊結石長期攜帶會拖成膽囊癌嗎?這也是讓無數臨床醫生感到困惑的問題。本研究探查了不同隨訪時間的膽囊結石患者和膽囊癌患者,其膽囊組織在轉錄水平上的相似性、差異性,以及結石轉癌的進化關系。

研究方法

本研究入組30例膽囊結石患者,其中10例患者初診至手術時間為1-3年(GS3),10例患者為5-10年(GS5),10例患者>10年(GS10)。取患者的術后膽囊粘膜組織進行RNA-seq分析。同時入組10例病理確診的膽囊癌患者(GBC),取癌和癌旁組織進行RNA-seq分析。

體外實驗:對膽囊癌細胞系GBC-SD、SGC-996以及GPR-87 knockdown細胞系GBC-SD shGPR-87、SGC-996 shGPR-87,分別進行細胞克隆形成、細胞擴增、細胞遷移/侵襲實驗。

圖1 研究流程示意圖

研究結果

膽囊癌 vs. 癌旁

與癌旁相比,膽囊癌組織中發現1704個差異表達基因,其中523個基因表達水平上調,1181個基因表達水平下調(圖2A)。KEGG信號通路富集分析表明,幾條著名的癌癥相關信號通路發生改變如PI3K-Akt、MAPK、Ras、Wnt等(圖2C)。其中富集最顯著的信號通路是neuroactiveligand-receptor interaction。膽道系統的惡性腫瘤有一個共同的生物學特性就是沿管壁呈浸潤性生長,特別容易發生神經侵犯,已有研究表明神經侵犯是腫瘤復發的一個重要因素。

圖2 膽囊癌vs.癌旁(A)差異表達基因火山圖;(B)差異表達基因熱圖;(C)差異表達基因信號通路富集分析結果(TOP15)。


膽囊結石vs. 膽囊癌

圖3和圖4表明膽囊結石患者與膽囊癌患者的相似性由低到高分別是5-10年(GS5)、10年(GS10)和1-3年(GS3)患者。我們認為膽囊組織與膽囊癌的轉錄組越相似,患癌風險越高。

圖3 (A) 與膽囊癌比,膽囊結石的差異表達基因數目;(B)膽囊癌、膽囊結石(GS3/GS5/GS10)基于轉錄組測序的韋恩圖。

通過韋恩圖分析(圖4B),我們發現了與膽囊結石患者癌變風險最相關的40個基因。對這40個基因進行信號通路富集分析,發現其主要與免疫相關。通過對40個基因的表達水平做時序分析,我們發現兩個非常有意思的基因ALPP和GPR87。這兩個基因在GS5組(風險最低組)不表達,其表達水平隨患癌風險升高而升高(圖4D、E)。

圖4(A)不同時間分組的膽結石患者的患癌風險排序;(B)韋恩圖尋找關鍵基因;(C)40個關鍵基因的信號通路分析;(D,E)ALPP和GPR87基因表達水平時序分析。

體外實驗表明,GPR87敲減后的膽囊癌細胞系,與對照細胞系比,其擴增、克隆形成能力、侵襲和轉移能力均受到抑制,證明GPR87在膽囊癌變過程中起關鍵作用。

圖5 GPR87敲減的體外實驗。(A)Western blotting驗證GPR87敲減后的蛋白表達水平;(B)qPCR驗證GPR87敲減后的基因表達水平;(C)細胞擴增能力實驗;(D)克隆形成能力實驗;(E)Edu細胞增殖檢測。

討論

為什么隨訪5-10年的膽結石患者患癌風險最低,而1-3年和>10年的患者風險更高?這似乎不符合我們的預期。臨床專家給出以下解釋:臨床上收集的30例膽結石患者,都是由于患者伴有臨床癥狀如膽絞痛、膽囊炎等,符合手術指征,從而行膽囊切除術。1-3年的膽結石患者是臨床上發病急、病情進展快的一組患者。我們的分析結果表明,癥狀出現早、發病急是高癌變風險的一個早期預警。而隨訪時間>10年的患者,盡管患者無臨床癥狀或癥狀出現晚,但是膽囊長期遭受慢性粘膜創傷和炎癥刺激,而炎癥刺激被認為是膽囊癌變的關鍵驅動因素。

臨床治療上,我們給出哪些建議?

對于有臨床癥狀、達到手術指征的膽結石患者,建議行膽囊切除術。對于無癥狀的膽結石患者建議臨床觀察隨訪。當膽結石攜帶時間超過10年時,患癌風險增加,建議手術切除。

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